Экспресс-анализ выявляет устойчивый к пиразинамиду туберкулез

Туберкулез (ТБ), вызываемый штаммами микобактерии туберкулезного комплекса (Mycobacterium tuberculosis complex - MTBC), остается одним из самых частых инфекционных заболеваний в мире. В связи с высокой частотой и повышенным риском сопутствующей резистентности к другим лекарствам быстрое выявление устойчивости к пиразинамиду (ПЗА) имеет важное значение для борьбы с эпидемией множественной лекарственно-резистентной формы туберкулёза (МЛУ-ТБ).

Пиразинамид является ключевым антибиотиком для лечения лекарственно-чувствительного туберкулеза. Устойчивость к ПЗА в основном опосредуется мутациями в гене pncA; однако нынешний золотой стандарт представляет собой фенотипический тест на чувствительность к лекарственным препаратам, требующий хорошо отрегулированного значения pH для надежных результатов. Тем не менее тестирование на резистентность к ПЗА обычно не проводится.

Группа микробиологов в сотрудничестве с Alere Technologies GmbH (Йена, Германия) использовала 271 клинический изолят MTBC из материала, полученного в результате национального исследования лекарственной устойчивости в Свазиленде, для клинической оценки анализа кривой плавления. Все изоляты были предварительно проанализированы с помощью секвенирования по Сенгеру гена pncA с использованием фланкирующих праймеров из положения от –104 до 560 из 561 кодирующего нуклеотида. Анализ последовательности показал генотип дикого типа для 153 изолятов и различные мутации в анализируемой последовательности pncA для 118 изолятов.

Для тестирования редких мутаций (Ala25Ala, Ser74Ser, Leu116Arg и Asn147Asn) плазмиды с соответствующими последовательностями были получены Eurofins Genomics GmbH (Эберсберг, Германия). Матричные зонды имели C7-амино-линкер для иммобилизации на твердоматричной фазе. Прямые праймеры для анализа кривой плавления были помечены Cy5 на 5'-конце, тогда как обратные праймеры для анализа кривой плавления не имели метки, как и праймеры для анализа TaqMan. Анализ кривой амплификации и плавления проводился в прототипном картридже, производимом Alere Technologies GmbH.

Исследователи сообщили, что анализ кривой плавления обнаруживает генотип не дикого типа в выбранных областях pncA, по крайней мере в 3750 копиях гена/мл в течение 2,5 часов. Эффективность анализа кривой плавления оценивали с 271 клиническим изолятом из Свазиленда. Из 118 изолятов с 21 различной мутацией pncA 98 (83,05%) были обнаружены как генотипы не дикого типа. По сравнению с секвенированием по Сенгеру анализ кривой плавления показал чувствительность 83,05% и специфичность 100%.

Авторы пришли к выводу, что текущий прототипный картридж содержит 57 различных зондов, но его максимальная емкость составляет 88 зондов для анализа с помощью гибридизации на микрочипах. Анализ уже обнаруживает достоверно ДНК MTBC до 3750 копий гена/мл с временем обработки 2,5 часа и работает с геномной ДНК, а также с клеточными лизатами. Тест может быть автоматически выполнен в закрытом картридже с использованием анализатора Alere q с питанием от батареи и может быть применен в условиях ограниченных ресурсов в качестве портативного теста, позволяющего быстро включать ПЗA в схемы лечения на ранних стадиях. Исследование было опубликовано в июньском выпуске журнала “Диагностическая микробиология и инфекционные заболевания” (Diagnostic Microbiology and Infectious Disease).