Для диагностики болезни Шагаса улучшена техника выделения ДНК

Болезнь Шагаса, вызываемая простейшим паразитом Trypanosoma cruzi, является эндемической во многих частях Северной и Южной Америки, где ей инфицировано от шести до семи миллионов человек. В острой фазе инфекции серологические реакции все еще могут быть отрицательными, но положительными на паразита при микроскопическом исследовании или при культивировании в специализированной среде.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала немаловажным и чувствительным диагностическим инструментом. Тест очень чувствителен для диагностики острой и врожденной формы болезни Шагаса. Обычная ПЦР имеет несколько недостатков, в первую очередь риск перекрестной контаминации. По этой причине в настоящее время более широко используется количественная ПЦР (кПЦР).

Ученые из Университета Каэтано Эредиа (Cayetano Heredia University, Лима, Перу) и их коллеги усовершенствовали и разработали более чувствительный метод извлечения ДНК паразита из образца сгустка крови для диагностики болезни Шагаса. Всего было проанализировано 265 парных образцов цельной крови с применением гуанидина (GEB) и образцов сгустка; 150 были взяты у серопозитивных пациентов с болезнью Шагаса. ДНК выделяли как из образцов цельной крови с гуанидином, используя ранее стандартизированную методологию, так и из образцов сгустка, используя недавно разработанную методологию, основанную на комбинировании метода FastPrep и стандартного метода экстракции GEB.

Образцы крови, смешанные с гуанидином/ЭДТА (GEB), подготавливали с использованием набора для матриц ПЦР High Pure PCR Template Preparation kit. Была выполнена дуплексная кПЦР, направленная на сателлитную последовательность ядерного генома T. cruzi и последовательность внутреннего контроля амплификации. Диагноз болезни Шагаса в образцах человека был основан на серологических исследованиях. Ферментно-связанные иммуносорбентные анализы (ELISA) проводились с использованием Chagatek Wiener Recombinante v3.0 ELISA. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) была проведена с использованием набора Chagas Polychaco. Также был выполнен вестерн-блоттинг.

Команда сообщила, что из 265 проанализированных образцов 150 были взяты у серопозитивных пациентов с болезнью Шагаса. Средняя концентрация ДНК в образцах сгустка была выше, чем в GEB-образцах. Из 150 образцов от Шагас-положительных индивидуумов по результатам серологии 47 образцов дали положительный результат при помощи кПЦР с ДНК, выделенной как с помощью GEB, так и сгустка крови, но дополнительные 13 образцов дали положительный результат только по ДНК, выделенной из сгустка. Серологически отрицательные образцы не дали положительных результатов при тестировании с помощью кПЦР. Согласованность между кПЦР с использованием ДНК из сгустка и ДНК ГЭБ составила 95,9%.

Авторы пришли к выводу, что их усовершенствованная методология обнаружения ДНК T. cruzi с использованием сгустка крови может улучшить раннюю диагностику и, следовательно, позволит оптимизировать лечение и прогноз для инфицированных людей, особенно с малой плотностью паразитов, присутствующих в крови. Исследование было опубликовано 11 января 2019 года в журнале PLOS Neglected Tropical Diseases.

Ссылки по теме:
Cayetano Heredia University