Метод изотермической амплификации ДНК обнаруживает онхоцерки в образцах биопсии кожи

 Онхоцеркоз, заражение нематодами Onchocerca volvulus, относящимися к семейству филярий, представляет собой забытую тропическую болезнь, которая известна прежде всего как речная слепота. Диагностические процедуры для обнаружения заражения этим паразитирующим организмом из класса нематод в настоящее время основаны на обнаружении микрофилярий в образцах биопсии кожи с помощью микроскопического исследования.

Метод изотермической амплификации обеспечивает выполнение простого процесса, который быстро и эффективно аккумулирует нуклеиновые кислоты при постоянной температуре. В отличие от амплификации на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) нет необходимости в температурных циклах, что облегчает его интеграцию в микросистемы или портативные устройства.


Команда ученых, сотрудничающих с командой Janssen Diagnostics (Раритан, штат Нью-Джерси, США), собрала образцы биопсии кожи в рамках исследования в полевых условиях в Гане. Были проведены медицинские осмотры, чтобы выявить тех пациентов, которые имели узелки, обнаруживаемые при пальпации. У каждого участника были взяты по две биопсии кожи, перенесены в отдельные ячейки с закруглённым дном 96-луночного планшета, погружены в физиологический раствор, и после выдерживания в термостате в течение ночи при комнатной температуре каждый образец биопсии был исследован под микроскопом, а появившиеся микрофилярии O. volvulus были подсчитаны.

Геномная ДНК была извлечена из каждого образца биопсии кожи, используя комплект OMEGA E.Z.N.A. tissue DNA (компания Omega Bio-tek, Норкросс, штат Джорджия, США). Количество и качество извлеченной ДНК были оценены с помощью спектрофотометра ND-1000 NanoDrop (компания Thermo Scientific, Уолтэм, штат Массачусетс, США). Праймеры для изотермической амплификации с формированием петель были разработаны адресно взаимодействующими с митохондриальной ДНК O. volvulus. Был определен предел обнаружения изотермической амплификации с формированием петель, позволяющий получить воспроизводимый при проведении исследования положительный сигнал.

Ученые сообщили, что анализ серии разбавлений искусственно созданной ДНК, содержащей целевую последовательность, показывает нелинейную кривую зависимости концентрации, которая обычно бывает при методах изотермической амплификации. Оценка перекрестной реактивности с гетерологичной последовательностью близкородственных паразитических организмов Wuchereria bancrofti, Loa loa и Brugia malayi продемонстрировала значительную специфичность, поскольку ни одна из этих последовательностей не была амплифицирована.

По сравнению с количественной полимеразной цепной реакцией чувствительность метода изотермической амплификации с формированием петель составляла 88.2%, специфичность – 99.2%. Авторы пришли к заключению, что они разработали чувствительный и специфичный метод изотермической амплификации с формированием петель для обнаружения ДНК O. volvulus в образцах биопсии кожи, который способен обеспечить получение результатов в течение 30 минут. Исследование было опубликовано 1 декабря 2016 года в журнале Parasites & Vectors.

Ссылки по теме:
Janssen Diagnostics
Omega Bio-tek
Thermo Fisher Scientific