Сухая петлевая изотермическая амплификация образцов крови диагностирует африканский трипаносомоз

Петлевая изотермическая амплификация (loop-mediated isothermal amplification, или LAMP) представляет собой быстрый и точный инструмент, используемый для диагностики множества инфекционных заболеваний, однако по-прежнему требующий сложных этапов подготовки образцов и хорошо оборудованной лаборатории, чтобы получать надежные и воспроизводимые результаты.

Несколько существенных изменений в методе LAMP были произведены с целью предоставления возможности выполнения локальной диагностики африканского трипаносомоза человека в отдаленных районах с ограниченными лабораторными средствами.


Ученые из Университета Хоккайдо (Саппоро, Япония), в сотрудничестве с коллегами в Замбии, усовершенствовали существующий метод LAMP для диагностики африканского трипаносомоза человека, который является экономически выгодным и устойчивым при воздействии высокой температуры. В их методе лизированная кровь может использоваться напрямую с высокой чувствительностью обнаружения. Этот метод сухой петлевой изотермической амплификации может широко применяться в полевых условиях или для диагностики у постели больного даже в областях, испытывающих недостаток в технических возможностях соответствующего уровня.

Первое существенное улучшение заключалось в том, что реагенты для проведения петлевой изотермической амплификации высушивались и стабилизировались в одной пробирке за счет введения трегалозы в качестве криопротектора, чтобы продлить срок годности при температуре окружающей среды. Второе техническое улучшение было достигнуто за счет упрощения этапа подготовки образцов таким образом, что ДНК или рибонуклеиновая кислота (РНК) могли быть амплифицированы непосредственно из образцов крови, лизированных детергентами. Наборы праймеров были оценены методом LAMP в режиме реального времени; кроме того, с помощью анализа кривой плавления, при использовании термоциклера Rotor-Gene 3000 (компания Corbett Research, Сидней, Австралия), для определенных наборов праймеров был выполнен контроль реакции, оптимального времени амплификации и температуры.

Исследователи разработали набор красителей, который получил название “цветовой флуориметрический индикатор” (colori-fluorometric indicator, или CFI), для реакции LAMP. Они также разработали светодиодный светильник для сборки вручную с питанием от аккумуляторной батареи, который испускает свет с длиной волны 500 нм и подходит для использования в полевых условиях или у постели больного. Используя CFI, реакции LAMP могут быть определены двумя способами: либо путем обнаружения продуктов амплификации ДНК с GelGreen, либо за счет сниженной концентрации магния (Mg2 +) с гидроксилнафтол синим (hydroxyl-naphtol blue, или HNB). Возникающая флюоресценция была заметна в сине-зеленом свете светодиодного светильника. Цвет гидроксилнафтол синего изменился от фиолетового до синего в ходе реакции LAMP, поскольку концентрация иона Mg2+ снизилась, образуя нерастворимый пирофосфат магния. Эти переходы окраски были легко заметны невооруженным глазом. Чувствительность, как было определено с помощью десятикратного предела обнаружения, оказалась сопоставима с аналогичным показателем для кальцеина (флуорексона), обычно используемого индикатора для LAMP.

Авторы пришли к заключению, что они усовершенствовали метод LAMP для обнаружения африканского трипаносомоза человека, обеспечивая выполнимость LAMP для диагностики у постели больного и исследований в полевых условиях. Их метод LAMP может быть применен к целому ряду других инфекционных заболеваний и создает условия для возможного использования молекулярных диагностических экспресс-тестов в местах оказания медицинских услуг в странах со слаборазвитыми техническими возможностями. Африканский трипаносомоз человека представляет собой эндемическое протозойное заболевание, поражающее множество африканских стран, преимущественно в сельской местности, где присутствует переносчик инфекции муха цеце. Исследование было опубликовано 13 марта 2015 года в журнале Public Library of Science Neglected Tropical Diseases.

Ссылки по теме:
Hokkaido University
Corbett Research