Техника метагеномного механического фрагментирования ДНК обнаруживает бактерии туберкулеза в образцах пациентов без необходимости выращивания микроорганизмов или их обогащения

Исследователи инфекционных заболеваний разработали новый подход для диагностики туберкулеза, основанный на метагеномике механического фрагментирования ДНК (shotgun metagenomics) – методе прямого секвенирования ДНК, извлеченной из образцов слюны. Данный метод обнаруживает и характеризует вызывающие туберкулез микобактерии без необходимости в выращивании микроорганизмов или обогащении, которые занимают много времени.

Метагеномика представляет собой исследование генетического материала, извлеченного непосредственно из природных образцов. В метагеномном секвенировании ДНК извлечена непосредственно из природных образцов случайным способом с целью получения беспристрастной выборки из всех генов всех участников группы населения. В недавних исследованиях использовалось секвенирование по Сенгеру методом "дробовика" (shotgun Sanger sequencing) или пиросеквенирование, чтобы восстановить последовательности считываемых фрагментов. Секвенирование методом "дробовика" представляет собой метод секвенирования, разработанный для анализа последовательностей ДНК длиннее 1000 пар нуклеотидов, вплоть до всех хромосом. Этот метод требует разделения целевой ДНК на случайные фрагменты. После секвенирования отдельных фрагментов последовательности могут быть повторно собраны на основе их перекрывающихся областей.


Исследователи из Уорикской медицинской школы (Соединенное Королевство) изучили потенциальные возможности метагеномики механического фрагментирования ДНК для обнаружения и определения штаммов из комплекса Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты с положительными результатами мазков. С этой целью они проанализировали восемь образцов, полученных от больных туберкулезом из Гамбии.

Концентрация ДНК, присутствующая в каждом извлеченном образце, была определена с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Invitrogen Ltd., Пейсли, Соединенное Королевство) и набора реагентов Qubit dsDNA, согласно протоколу производителя, с использованием наборов HS (для высокочувствительного определения) или BR (для определения в широком диапазоне) в зависимости от концентрации ДНК. С помощью набора Qubit dsDNA HS, который обладает чувствительностью до 10 пикограмм на микролитр, в отрицательных контрольных образцах не было найдено ДНК, поддающейся обнаружению. Извлеченные образцы ДНК были разбавлены до 0,2 нанограммам на микролитр и затем конвертированы в библиотеки нуклеотидных последовательностей с помощью комплекта для подготовки образцов Nextera XT компании Illumina (Литл Честерфорд, Соединенное Королевство). Библиотеки были секвенированы на приборе MiSeq компании Illumina в Уорикском университете.

Используя эту методологию, исследователи смогли обнаружить последовательности из комплекса M. tuberculosis во всех восьми образцах, с охватом референсного генома штамма H37Rv в пределах от 0.002X до 0.7X. Анализируя распределение многочисленных полиморфизмов последовательности (делеции и локации встроенного элемента IS6110) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), они смогли распределить семь из восьми геномов, определенных посредством метагеномной техники, к видам и клеточной линии в составе комплекса M. tuberculosis. Два микобактериальных генома, выявленных при метагеномном исследовании, были отнесены к M. africanum – видам, главным образом локализованным в Западной Африке; другие, которые могли быть распределены, относились к T, H или LAM в составе филогенетической ветви современных штаммов M. tuberculosis.

“Лабораторная диагностика туберкулеза с использованием традиционных подходов представляет собой слишком продолжительный процесс, который занимает недели или месяцы, — сказал старший автор, доктор Марк Паллен (Mark Pallen), преподаватель геномики микроорганизмов в Уорикской медицинской школе. — Метагеномика, за счет использования самых современных технологий высокопроизводительного секвенирования и некоторых высокотехнологичных методов биоинформатики, позволяет нам обнаруживать и характеризовать бактерии, которые вызывают туберкулез, за считанные дни без необходимости в выращивании бактерий, и в то же время дает нам правильное представление о последовательностях их генома и клеточных линиях, к которым они принадлежат. Мы обеспечили проверку и подтверждение принципа действия метода, но еще предстоит повысить чувствительность метагеномной техники и улучшить наши производственные процессы. Однако, за исключением возражений, можно порадоваться тому факту, что метагеномика готова описывать инфекции, существовавшие в прошлом и существующие в настоящее время, давая представление о возникновении, эволюции и распространении болезнетворных микроорганизмов”.

Исследование метагеномики механического фрагментирования ДНК было опубликовано 23 сентября 2014 года в интернет-версии журнала PeerJ.

Ссылки по теме:
Warwick Medical School
Invitrogen Ltd.
Illumina